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ELISPOT結果分析之——細胞數與斑點頻率

作者:admin 信息來源:達科為 日期:20130830 打印 字體:  
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ELISPOT檢測的是陽性細胞的頻率,也就是出斑點的細胞占整個加入細胞的比例。不僅要計數斑點,也要計數孔中加入的細胞。每孔加入的細胞有一個上限,大約是60萬,這是96孔板每個孔能容納的細胞極限,超過這個極限,細胞就不再單層平鋪在孔底了。而ELISPOT檢測的前提條件是細胞單層平鋪在孔底。

理論上說,同一次實驗,孔內的斑點數量應該和加入孔中的細胞數量成正比,不論加入細胞多少,陽性細胞的頻率是恒定的。正是基于這一前提,ELISPOT檢測的單位被定義為,每百萬細胞中陽性細胞的數目,英文SFC/Million (Spots Forming Cells per Million cells)。

但是實際情況究竟怎樣呢,斑點數量真的和細胞數量成正比嗎?

經過反復的實踐,我們發(fā)現這條規(guī)律只有在特定的前提下才成立。這個前提就是有足夠的抗原呈遞細胞(APC)密度,以滿足細胞間的相互作用。由于特異性的ELISPOT反應都需要APC把抗原呈遞給T細胞,所以只有APC充足的時候,斑點數目才和細胞數目成正比。

通常的ELISPOT檢測是不單獨制備APC的,而是依靠混合在淋巴細胞中的APC擔負抗原呈遞的作用。好在PBMC和小鼠脾臟淋巴細胞都含有足夠的APC,在特定的細胞濃度下都會發(fā)揮正常的抗原呈遞功能。另外,不同的刺激物類型對APC的要求也不一樣,需要具體情況具體分析。


非特異性刺激物


非特異性的刺激物可以直接刺激淋巴細胞,這種刺激不依賴于APC或者其它輔助細胞,是單細胞反應行為。所以它對細胞密度沒有要求,在極寬的細胞濃度范圍之內——多至40萬/孔,低至5千/孔——斑點數量和細胞數量都有簡單的正比例關系,參見圖4.2。但是考慮到,只有恰當的斑點數目才便于數據統(tǒng)計,所以推薦細胞密度為10萬/孔。如果細胞數目過多,滿孔都會被斑點覆蓋,并且相互重疊。



T細胞表為肽/CEF/ICE

T細胞表位肽比較特殊。一方面,它需要APC的呈遞,是雙細胞反應行為;另一方面它不需要APC的加工,對于APC的依賴相對較低。以使用ICE多肽庫為例,實踐中我們發(fā)現在5萬/孔—60萬/孔的細胞濃度范圍內,都可以獲得很好的斑點數與細胞數的線性關系(參見圖4.2)。通常我們推薦20萬/孔的細胞密度。如果在這樣的細胞密度下,斑點過多或者過少,可以根據實際情況,在線性范圍許可的限度內減少或者增加每孔種植的細胞密度。


普通多肽/蛋白/組織提取物

不論是普通多肽(比如重疊多肽庫)還是蛋白質或者蛋白類的組織提取物,這些刺激物都需要APC的攝取、內化、加工、呈遞,之后T細胞才能被刺激。所以,使用這些刺激物的時候,一定要保證足夠的細胞密度。根據我們的經驗,細胞密度要至少達到20萬-30萬每孔。多肽推薦的細胞密度為30萬/孔,蛋白推薦的細胞密度為40萬/孔。也可以根據實際情況,在線性范圍內調整,參見表4.1與圖4.2。

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