1．紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2．將所需的培養基確保瓶身干凈后放于工作臺面內，點燃酒精燈，將培養基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將培養基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側。

3. 將培養瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側后將培養瓶內的培養液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，

4．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養基瓶內吸取4ml培養基再懸空移入培養瓶內，將培養瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放。

5．將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

6. 將培養瓶放于28℃,5%CO2的培養箱內培養，旋開瓶口少許。

   每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代。