淋巴細胞（lymphocyte）是由淋巴器官（包括淋巴結、脾臟以及胸腺）產生的體積最小的白細胞。主要存在于淋巴管中循環的淋巴液中，是機體免疫應答功能的重要細胞成分，是淋巴系統幾乎全部免疫功能的主要執行者，是對抗外界感染和監控體內細胞變異的一線“士兵”。淋巴細胞是一類具有免疫識別功能的細胞系，按其發生遷移、表面分子和功能的不同，可分為T淋巴細胞（T細胞）、B淋巴細胞（B細胞）和自然殺傷(NK)細胞。
 

脾臟是機體重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴細胞，占全身淋巴組織總量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，從外周血液中分離大量淋巴細胞較為困難，故經常需要從其鼠脾臟中獲取大量的淋巴細胞。傳統淋巴細胞方法分離存在諸多不足，比如分離液本身存在細胞毒性，分離者需要自行調節分離液密度梯度，分離所得細胞活率不高、狀態不好、純度不夠等。鑒于此，達科為生物公司開發了一種小鼠淋巴細胞分離液（貨號7211011），本分離液具有完全化學惰性、無生物毒性的碘化物，不會結合任何已知的生物功能蛋白，不會干擾任何細胞表面膜蛋白，不抑制酶活性，不會干擾抗原抗體反應等多優勢，并且能同時適用于小鼠外周血和脾臟組織中淋巴細胞的分離，分離操作十分簡單（小白看一遍都能學會）。

操作步驟

1. 斷頸處死小鼠，浸泡于 75% 的乙醇中。

2. 在超凈臺中取出小鼠脾臟。注意無菌操作。

3. 在 35mm 培養皿中放入 4mL-5mL 小鼠淋巴 細胞分離液（取用前恢復至室溫并搖勻）。研 磨（研磨操作請參考圖二）。

4. 把懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到 15mL 離心管中，如圖一（A），覆蓋 500μL-1000μL 的 RPMI 1640 培養基（保持液面分界明顯）， 如圖一（B）。

5. 室溫，水平轉子 800g 離心 30min。設置較慢 的加速度和減速度，如果有十檔，設為第三 檔。離心結束后細胞分層如圖一（C）所示。

6. 吸出淋巴細胞層，再加入 10mL RPMI 1640 培養基，顛倒洗滌。室溫，250g 離心 10min 收集細胞。

7. 傾倒上清液，用培養液重懸細胞，計數。

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注意事項

大鼠脾臟淋巴細胞分離操作：因大鼠脾臟較大，只須剪取一小部分進行實驗即可，研磨與分離的方法與小鼠脾臟淋巴細胞的分離 操作完全相同。

小鼠／大鼠／兔子血液中淋巴細胞分離操作：

1.新鮮采集的小鼠/大鼠/兔子抗凝血液 0.5mL-3mL 用 RPMI 1640 或 PBS 稀釋一倍（血液稀釋后分離 效果更佳，注意無菌操作）。

2.在 15mL 離心管中加入 3mL 淋巴細胞分離液。小心地將經過稀釋的血液平鋪在淋巴細胞分離液液 面上層，避免兩種液體界面混合。

3.室溫，水平轉子 800g 離心 15min-20min。設置較慢的加速度和減速度（如果有十檔，設為第三檔）。

4.后續步驟與小鼠脾臟淋巴細胞分離操作相同。

特別說明——關于小鼠脾臟研磨的達科為方法：

 

☆ 推薦使用尼龍網，因為尼龍網更柔韌。

☆ 推薦使用注射器活塞來研磨脾臟。

☆ 關鍵所在，利用尼龍網向上的反彈力來控制研磨的力度， 將細胞可能受到的機械損傷降低到最小。

注意：

1.控制研磨力度，使尼龍網保持懸空，避免在皿底上直接 研磨而造成大批細胞死亡。

2.平皿的口徑不能太大，否則尼龍網不能產生有效的彈力。

3.鑷子在一邊夾住尼龍網，防止尼龍網在研磨過程中滑動。

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